D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S.N.Elansky, P.N. Balabko, G.L. Belova, S. K. Zavriev
Fitopatojenik mantar Colletotrichum kod kodları, antraknoz ve yumru kara lekesi olarak bilinen patates ve domateslerde tehlikeli hastalıklara neden olur. Morfolojik özelliklerinden dolayı, diğer mikroorganizmaların neden olduğu hastalıklardan ayırt etmek genellikle zordur; yeşil domates meyvelerinde hastalık asemptomatik olabilir ve kendisini yalnızca olgun kırmızı meyvelerde gösterir. Patojenin hızlı ve doğru teşhisi için gerçek zamanlı bir PCR test sistemi sunulmaktadır. Bir test sistemi geliştirmek için, Rusya'nın farklı bölgelerindeki patates yumrularından izole edilen 45 C kodlu suşların gliserol trifosfat dehidrojenaz geninin nükleotid sekansı belirlendi.
Elde edilen sonuçlara ve GenBank veri tabanında bulunan diğer türlerin benzer dizilerinin analizine dayanarak, türe özgü primerler ve C. kod kodları için sonda tasarlandı. Oluşturulan test sisteminin özgüllüğünü kontrol etmek için PCR, domates ve patates bitkileriyle (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum kod kodlarıyla ilişkili 15 farklı parazitik ve saprotrofik mantar türünün) saf kültürlerinden izole edilen DNA ile gerçekleştirildi. Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Colletotrichum kod kodlu DNA'nın varlığı, 20-27 eşik döngüsünde belirlendi, diğer türler ise 40 döngüden sonra tespit edildi veya tespit edilmedi. Test sistemi, analiz edilen PCR karışımında 0.01 ng / mm3'ün üzerindeki DNA konsantrasyonlarını güvenilir şekilde tespit etmeyi mümkün kılar. Geliştirilen test sistemi kullanılarak, mantar hastalığı semptomları olan domates yapraklarında ve hastalığın dış semptomları olmayan patates yumrularında C. coccodes varlığı araştırılmıştır. Kostroma, Moskova, Kaluga, Nizhny Novgorod bölgelerindeki tarlalardan, Krasnodar bölgesindeki iki farklı alandan mantar enfeksiyonu belirtileri olan yapraklar toplandı. Krasnodar Bölgesi'nde C. coccodes DNA'sı içeren bir domates yaprağı bulundu; Kostroma, Moskova, Kaluga bölgelerinde yetiştirilen 5 yumru kök örneğinde bu patojenin önemli bir DNA varlığı tespit edildi.
Giriş
Colletotrichum cinsinin mantarları, tahılları, sebzeleri, otları, çok yıllık meyveleri ve meyve bitkilerini etkileyen tehlikeli fitopatojenlerdir. Bu cinsin her yerde bulunan türlerinden biri olan Colletotrichum kod kodları (Wallr).
Hughes, antraknozun ve patates ve domatesin kara lekesinin nedensel ajanıdır ve Solanaceae ailesinin diğer bazı bitkilerinin hastalıklarına neden olur. yabani otlar (Dillard, 1992). C. kod kodları bitkinin tüm yer altı kısımlarını, gövde tabanlarını, yaprakları ve meyveleri etkiler (Andrivon ve diğerleri, 1998; Johnson, 1994). Enfekte patates yumrularının kabuğunda, üzerinde siyah sporülasyon ve mikro sklerotia noktalarının açıkça görülebildiği, belirsiz olarak belirgin kenarlara sahip gri lekelerin gelişimi gözlenir. Saklama sırasında yumru köklerin hamurunda yumuşatılmış içerikli ülserler oluşabilir; hastalık antraknoz fazına girer, ancak bu son derece nadirdir.
Aynı zamanda, antraknoz semptomları (küçük siyah noktalı deri ülserleri) domates meyvelerine özgüdür. Yapraklarda, C. kod kodlarının semptomları, genellikle sarı doku ile çevrelenen koyu kahverengi lekeler olarak görünür (Johnson, 1994).
Yumrular üzerindeki siyah lekenin gelişimi, özellikle yıkanmış kırmızı kabuklu patateslerin satılması sırasında belirgin olan görünümlerini bozar. Soyulma pul pul dökülmesi aşırı buharlaşmaya ve depolama kayıplarının artmasına neden olur (Hunger, McIntyre, 1979). Diğer bitki organlarının zarar görmesi, hem açık hem de kapalı zeminde görülen verim kaybına neden olur (Johnson, 1994; Tsror ve diğerleri, 1999). C. kod kodlarının neden olduğu hastalıklar, Rusya dahil dünyanın hemen hemen tüm patates üreten bölgelerinde yaygındır (Leesa, Hilton, 2003; Belov ve diğerleri, 2018). Bu hastalıkların kontrolü, mevcut fungisitlerin C. kod kodlarına karşı yetersiz etkinliği ve dirençli çeşitlerin olmaması nedeniyle zordur (Read, Hide, 1995).
C. coccodes aşısı tohum yumrularında (Read and Hide, 1988; Johnson et al., 1997), domates tohumlarında (Ben-Daniel et al., 2010) uzun süre toprakta, bitki artıkları üzerinde hayatta kalabilir (Dillard, 1990 ; Dillard, Cobb, 1993) ve yabani otlarda (Raid, Pennypacker, 1987). Bir dizi yazarın çalışmaları (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson ve diğerleri, 1997; Dillard, Cobb, 1993), hastalığın patates ve domateste gelişiminin büyük ölçüde tohumdaki aşı varlığına bağlı olduğunu göstermiştir. toprak. Bu nedenle, hastalıktan kaynaklanan kayıpları en aza indirmek için, tohum materyalinde, toprakta, tohumluk patates yumrularında ve depolama için serilen domates tohumlarında mantarın çoğalmasının teşhis edilmesi (kantitatif dahil) gereklidir. Toprakta ve bitki materyalinde morfolojik teşhis, ancak diğer mantar türlerinde de bulunan mikrosklerotların varlığı ile gerçekleştirilebilir.
Yumrular üzerindeki semptomlar, Helminthosporium solani mantarının neden olduğu gümüşi kabuklara çok benzer. Colletotrichum coccodes ve Helminthosporium solani'nin saf bir kültüre izolasyonu oldukça zordur ve bir besiyerindeki yavaş büyüme nedeniyle uzun zaman alır. Colletotrichum kod kodlarını hızlı bir şekilde tanımlamak için, araçsal tanı yöntemlerini kullanmak gerekir. En uygun yöntem, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve modifikasyonudur - gerçek zamanlı PCR. Şu anda, rDNA'nın ITS2002 bölgesi için İngiliz araştırmacılar (Cullen ve diğerleri, 1) tarafından geliştirilen bir test sistemi Avrupa ve Amerika Birleşik Devletleri'nde kullanılmaktadır. Rus izolatlarının analizinde kullanımı iyi sonuçlar göstermiştir (Belov ve diğerleri, 2018). Bununla birlikte, C. kod kodları oldukça değişkendir ve tek bir DNA dizisinden tespit edilmesi yanlış negatif sonuçlara yol açabilir. Daha güvenilir bir teşhis için, gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz geninin sekansı ile C. kod kodlarının tanımlanmasına izin veren orijinal bir test sistemi geliştirdiğimizle bağlantılı olarak birkaç türe özgü DNA sekansı için analiz gereklidir.
Malzemeler ve yöntemler
Oluşturulan test sistemlerinin verimliliğini ve özgüllüğünü değerlendirmek için, yazarlar tarafından hastalıklı domates yaprakları ve meyveleri, patates yumruları örneklerinden izole edilen 15 mantar türünün saf kültürlerini kullandık (Tablo 1). İzolasyon için, çalı başına birden fazla organ olmayacak şekilde mantar enfeksiyonu semptomları olan bitkilerin organları alındı.
Kabuğu olan bir yumru dilimi, bir dilim domates meyvesi ve etkilenen bir yaprak, bir binoküler mikroskop altına yerleştirildi, ardından miselyum, sporlar veya bir doku parçası, keskinleştirilmiş bir kesme iğnesi ile bir Petri kabındaki bir agar ortamına (wort agar) aktarıldı. İzolatlar, 4 ° C'de test tüplerinde eğimli agar üzerinde saklandı.
Hasattan hemen sonra (tarlada) mantar hastalıkları semptomları ile analiz için domates yaprağı numuneleri DNA izolasyonuna kadar bekletildikleri% 70 etil alkole yerleştirildi. Patates yumruları laboratuvara teslim edildi, onlardan soyuldu (2 × 1 cm parça) ve -20 ° C'de donduruldu. DNA izolasyonuna kadar dondurulmuş olarak saklanır.
DNA izolasyonu için saf mantar kültürleri sıvı bezelye ortamında yetiştirildi. Mantarın miselyumu sıvı ortamdan çıkarıldı, filtre kağıdı üzerinde kurutuldu, sıvı nitrojen içinde donduruldu, homojenleştirildi, CTAB tamponunda inkübe edildi, kloroform ile saflaştırıldı, bir izopropanol ve 0.5 M potasyum asetat karışımı ile çökeltildi ve iki kez% 2 alkol ile yıkandı. Elde edilen DNA, deiyonize suda çözüldü ve -70 ° C'de saklandı (Kutuzova ve diğerleri, 20). DNA konsantrasyonu, Qubit 2017 (Qiagen, Almanya) üzerinde çift sarmallı DNA için bir HS DNA kantifikasyon kiti kullanılarak ölçüldü. Alkollü ve dondurulmuş örnekler sıvı nitrojen içinde öğütüldü, ardından yukarıda açıklandığı gibi DNA izolasyonu yapıldı (saf mantar kültürlerinin miselyumu için).
Tablo 1. Kullanılan mantar türlerinin kaynağı
Mantar adı | Bitki, organ | Seçim yeri |
---|---|---|
Colletotrichum kod kodları 1, C. kod kodları 2, C. kod kodları 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | patates yumru | Kostroma bölgesi, 1. tarla neslinin patates yumruları, Red Scarlett çeşidi |
Colletotrichum kod kodları 4 | patates yaprağı | Rep. Mari El, Yoshkar-Ola |
helminthosporium solani | patates yumru | Magadan bölgesi, konum. Çadır, patates yumru |
kladosporium fulvum | domates yaprağı | Moskova bölgesi, iri meyveli domates |
Alternaria domatesi | domates meyvesi | Tüm Rusya Bitki Koruma Araştırma Enstitüsü mikoloji ve fitopatoloji laboratuvarı personeli tarafından teslim edildi. |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | domates meyvesi | Krasnodar Bölgesi, Krymsky bölgesi, sınıf Krem |
Fusarium oxysporum | buğday kökü | Moskova bölgesi |
PCR, bir DTprime amplifikatörü (DNA Teknolojisi) üzerinde gerçekleştirildi. PCR için, orijinal primerler ve gliserol trifosfat dehidrojenaz geninin türe özgü bölgesi için bir prob kullanıldı: ileri primer Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, ters primer Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1. Primerler, 213 bp'lik bir bölgeyi büyütür.
Reaksiyon 50 ng toplam DNA (yaprak ve yumruların analizinde) ve 10 ng (saf mantar kültürlerinin DNA analizinde) aldı. Reaksiyon karışımı (35 ul) bir parafin tabakası ile iki kısma ayrıldı: alttaki (20 ul) 2 ul 10 x reaksiyon tamponu (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2;% 0.1 Tween- 20), her bir deoksinükleotid trifosfattan 0.5 mM, her bir primerden 7 pmol ve hidrolize edilebilir bir floresan probunun 4 pmol'ü; üstteki 1 ul 10 x PCR tamponu ve 1 U Taq polimeraz içeriyordu.
Karışımın parafin ile ayrılması, tüplerin uzun süre 5 ° C sıcaklıkta saklanmasına ve 10 ° C'nin üzerinde 80 dakika ısıtıldıktan sonra PCR için sıcak bir başlangıç yapılmasına olanak sağlar. PCR, aşağıdaki programa göre gerçekleştirildi: 94.0 ° C - 90 sn (1 döngü); 94.0 ° C - 30 saniye; 64.0 ° C - 15 s (5 döngü); 94.0 ° C - 10 saniye; 64.0 ° C - 15 s (45 döngü); 10.0 ° C - saklama.
sonuçlar ve tartışma
Rusya'nın farklı bölgelerinde yapraklar, saplar, patates yumruları ve domates meyvelerinden izole edilen 45 suşta (Kutuzova, 2018) gliserol trifosfat dehidrojenaz gen sekansları belirlendi. Tüm suşların incelenen sekansları, iki nükleotidde farklılık gösteren 2 gruba ayrıldı. KY496634 ve KY496635 numaraları altında her iki grubun temsilcilerinin nükleotid dizileri GenBank'ta saklanmıştır.
Primerler coc70gdf, coc280gdr ve esasına göre tasarlanan cocgdz probu BLAST programı kullanılarak kontrol edildi (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) Colletotrichum cinsine ait gliserol trifosfat dehidrojenaz geninin tüm sekansları ve GenBank veri tabanında bulunan diğer organizmalar üzerinde.
Primerler ve prob ile oldukça homolog olan diğer organizmaların DNA bölgeleri bulunmadı.
Test sisteminin hassasiyeti, farklı konsantrasyonlarda C. coccodes DNA'sı, antraknozla enfekte olmuş bir patates yaprağının DNA'sı (2017'de Mari El, çeşit Red Scarlett'de toplanmıştır) ve siyah noktadan etkilenen yumruların soyulması (Kostroma bölgesinde toplanmış, çeşitliliği Red Scarlett, Tablo 2). Yumrularda ve patates yapraklarında DNA varlığını doğrulamak için, C. coccodes suşları onlardan saf kültürlere izole edildi.
Test sisteminin duyarlılık analizinin sonuçları, PCR karışımındaki toplam içeriği 0.05 ng'den fazla olduğunda bir örnekteki C. kodlu DNA varlığını başarılı bir şekilde teşhis etmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Bu, saptama için oldukça yeterlidir, çünkü bir sklerotia ortalama olarak 0.131 ng içerir ve bir spor, yaklaşık 0.04 ng DNA içerir (Cullen ve diğerleri, 2002). İngiliz grubu tarafından geliştirilen test sistemi (Cullen ve diğerleri, 2002) benzer bir duyarlılık göstermiştir (eşik döngüsü 34 0.05 ng DNA ve 37 0.005 ng).
Her durumda C. kod kodlarını içeren doğal numunelerin analizi, numunedeki varlığını güvenilir bir şekilde ortaya çıkarmayı mümkün kılmıştır (Tablo 2). DNA izolasyonu için önerilen yöntem, doğal bitki örneklerinin analizine de uygulanabilirdi.
Tablo 2. Gerçek zamanlı PCR için Colletotrichum kod kodlarının tanımlanması için önerilen test sisteminin hassasiyetinin belirlenmesi
Örnek | Örnekteki DNA miktarı *, ng | Eşik döngüsü | C. kod kodlarının tespiti |
---|---|---|---|
Miselyum Colletotrichum kod kodları | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Yumru kabuğu 1 | 50 | 32 | + |
Yumru kabuğu 2 | 50 | 30 | + |
Yumru kabuğu 3 | 50 | 31.5 | + |
Patates yaprağı | 50 | 29.5 | + |
Not. * PCR ürünleri karışımı halinde.
Test sisteminin özgüllüğü, 15 mantar türünden ekstrakte edilen DNA örnekleri üzerinde kontrol edildi. Tüm mantar türleri, yazarlar tarafından etkilenmiş ve sağlıklı meyve ve domates, patates yumrularının yapraklarından izole edilmiştir; buğday kökünden bir suş izole edildi (Tablo 1). Meyvenin yüzeyinden izole edilen türler arasında, domates için patojenik olmayan türler de vardır (örneğin Phellinus ferrugineovelutinus).
Çalışmalar, C. coccodes DNA'sının 20-27 eşik döngüsünde tespit edildiğini, diğer mantar türlerinin ise saptanmadığını veya 40. döngüden sonra bir sinyal verdiğini göstermiştir, bu da spesifik olmayan bir gürültü etkisine bağlanabilir (Tablo 3).
Tablo 3. Çeşitli mantar türleri için test sisteminin kontrol edilmesi
Mantar adı | Eşik döngüsü |
Colletotrichum kod kodları 1 | 20.9 |
C. kod kodları 2 | 22.6 |
C. kod kodları 3 | 23 |
C. kod kodları 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. dikey illüum | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis evresi | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. domatesgiller | > 40 |
helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vezikaryum | > 40 |
İlyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
akrodontiyum luzula | > 40 |
Penicillium sp. | > 40 |
Not. * Tüm örneklerdeki DNA miktarı 10 ng idi.
Geliştirilen test sistemi, nekrotrofik patojen semptomları olan domates yaprağı numunelerindeki C. kod kodlarını ve görünür semptomlar olmadan tohumluk patates yumrularını tanımlamak için kullanıldı. Çalışma için Kostroma, Moskova, Kaluga, Nizhny Novgorod bölgelerinde yetişen farklı çeşitlerin tohum yumrularını aldık. Eşik döngüsü 35'i geçmeyen analizlerde C. kodlu DNA'nın varlığı önemli kabul edildi. Bu eşik değeri, 0.05 ng C. kod kodlu DNA'nın güvenilir bir şekilde belirlenmesine (eşik döngüsü 33.5, Tablo 2) ve 40'ın üzerindeki eşik döngüleri, diğer bazı mantar türlerinin spesifik olmayan DNA'sı teşhis edildi. Bu yaklaşımla, Kostroma, Moskova, Kaluga bölgelerinde yetiştirilen 5 yumru yumru örneğinde ve Krasnodar bölgesinin Yeisk bölgesinden bir domates yaprağında C. coccodes DNA'sının önemli varlığı tespit edildi (Tablo 4, 5).
Tablo 4. Patates yumrularında Colletotrichum kod kodlarının tespiti *
Örnek numarası | Patates çeşitliliği | Büyüme yeri | C. kod kodlarının tespiti | Eşik döngüsü |
---|---|---|---|---|
1 | Kırmızı Kızıl | Kostroma bölgesi | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Moskova bölgesi | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky erken | Moskova bölgesi | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | muhallebi çocuğu | Kaluga bölgesi | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Fantezi | Kaluga bölgesi | - | |
15 | gala | Nizhny Novgorod bölgesi. | - | |
16 | - |
Not. * Tüm örneklerdeki DNA miktarı 50 ng idi.
Tablo 5. Domates yapraklarında Colletotrichum kodlarının tespiti *
Örnek numarası | Büyüme yeri | C. kod kodlarının tespiti | Eşik döngüsü |
---|---|---|---|
1 | Krasnodar Bölgesi, Kırım Bölgesi | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Krasnodar Bölgesi, Yeisk Bölgesi | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* Tüm örneklerdeki DNA miktarı 50 ng idi.
Tarafımızdan oluşturulan test sistemi, duyarlılık ve özgüllük açısından İngiliz araştırmacılar (Cullen ve diğerleri, 2002) tarafından geliştirilen sistemden daha aşağı değildir ve bitki örneklerinin analizi için uygundur. Tohum yumrularının analizi için uygulanması, dış hasar belirtileri olmaksızın yumrularda DNA kodlamasını gerçekleştirmeyi ve yaprak enfeksiyonunu başarılı bir şekilde analiz etmeyi mümkün kılmıştır.
Bugüne kadar, Rusya'da C. kod kodlarının istilasına yönelik patates yumrularının analizi yapılmamıştır. İlk çalışmamız, Rusya Federasyonu'nun farklı bölgelerinde yetiştirilen test edilen 16 yumru kökten 5'inin C. kod kodları içerdiğini gösterdi. Bu, patates yumrularının kara lekesinin Rusya'da yaygın bir patates hastalığı olduğunu ve patates mahsulünün hacmini ve kalitesini azaltmadaki rolünün hafife alındığını gösteriyor.
Domates yapraklarının analizi, Krasnodar Bölgesi'nin Yeisk bölgesinden bir yaprakta önemli miktarda C. coccodes DNA'sı olduğunu ortaya çıkardı. Daha önce, İngiliz test sistemi (Cullen ve diğerleri, 2002) kullanılarak güney Rusya'daki domates tarlalarını incelerken, C. kodlarını içeren yapraklar bulundu ve bazı tarlalarda C. kod kodlarıyla enfekte olmuş yaprakların yüksek bir oranı bulundu (Belov ve ark., 2018). Moskova Bölgesi Krasnodar ve Primorsky Bölgelerinde, saf C. coccodes kültürlerini izole etmeyi başardığımız domates meyveleri bulduk. Rusya'da C. coccodes'in domates üzerinde şu anda sanıldığından çok daha yaygın olması mümkündür ve zararlılığı da hafife alınmaktadır.
Böylelikle, bugüne kadar, C. kod kodlarının patates ve domates üzerindeki yaygın dağılımı hakkında yeterli bilgi toplanmıştır.
Bu mantarın patates ve domates hastalıklarının gelişimindeki rolünü daha iyi anlamak için, Rusya'daki yaygınlığının kapsamlı bir şekilde izlenmesi, toprak ve tohum enfeksiyonunun rolü üzerine çalışma ve depolama sırasında kayıplarda kara lekenin rolü gereklidir. PCR teşhisinin kullanılması bu çalışmayı önemli ölçüde kolaylaştırabilir ve her iki test sisteminin aynı anda kullanılması, analizin doğruluğunu önemli ölçüde artıracaktır.
Bu çalışma, 18-76-00009 sayılı Rus Bilim Vakfı'ndan bir hibe ile desteklenmiştir.
Makale "Mycology and Phytopathology" dergisinde (cilt 54, No. 1, 2020) yayınlandı.