YEMEK. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Son zamanlarda, askomiket mantarı Ilyonectria crassa'nın patates yumrularını enfekte edebildiği gösterilmiştir. Bu çalışma, patatesten izole edilen I. crassa suşunun biyolojik özelliklerini ve bazı fungisitlere karşı direnci analiz eden ilk çalışmadır. "Patates" türünün türe özgü bölgelerinin dizileri, nergis, ginseng, titrek kavak ve kayın, zambak soğanı ve lale yapraklarından izole edilen mantarlar için daha önce elde edilenlerle çakışıyordu. Görünüşe göre, birçok yabani ve bahçe bitkisi I. crassa'nın rezervleri olabilir. İncelenen suş, domates ve patates dilimlerini enfekte etti, ancak bütün domates meyvesini ve bozulmamış patates yumruunu enfekte etmedi. Bu, I. crassa'nın bir yara paraziti olduğunu gösterir. Besleyici bir ortamda fludioksonil, difenokonazol ve azoksistrobine karşı direncin değerlendirilmesi, bu ilaçların yüksek etkinliğini göstermiştir.
EC50 göstergesi (fungisidal olmayan kontrole göre koloninin radyal büyüme oranının 2 katı kadar yavaşlayan fungisit konsantrasyonu) 0.4'e eşitti; Sırasıyla 7.4 ve 4 mg / l. Patates yumrularının fitopatolojik değerlendirmesi ve bitki koruma önlemlerinin geliştirilmesi sırasında I. crassa'nın neden olduğu hastalığın gelişme olasılığı dikkate alınmalıdır.
Fitopatojen mikroorganizmaların gelişimi, patates yetiştirme ve depolamanın tüm aşamalarında yüksek kayıplara neden olur. Koruyucu önlemler planlanırken, kural olarak, Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora cinsi türleri gibi iyi bilinen patojenler dikkate alınmaktadır. Bununla birlikte, son yıllarda, patateslerde yeni fitopatojenik mikroorganizmaların ortaya çıkması hakkında giderek daha fazla rapor ortaya çıkmıştır. Biyolojileri yeterince çalışılmamış, patateslerde kullanılan fungisitlerin bunlarla ilgili etkinliği bilinmemektedir, teşhis yöntemleri geliştirilmemiştir. Kitlesel gelişme ile patates mahsulüne ciddi zarar verebilirler. Bu mikroorganizmalardan biri, ilk olarak patates yumruları üzerinde yazarlar tarafından keşfedilen askomiket mantarı Ilyonectria crassa (Wollenw.) A.Cabral & Crous'dur (Chudinova ve diğerleri, 2019).
Bu çalışma, patates yumrularından izole edilen I. crassa suşunun analizinin sonuçlarını sunmaktadır. I. crassa kolonilerinin morfolojisi ve miselyal yapıları, türe özgü DNA bölgelerinin nükleotid dizileri, patates ve domatese karşı virülans ve bazı popüler fungisitlere direnç incelenmiştir.
Malzemeler ve yöntemler
Kostroma bölgesinde yetişen enfekte patates yumrularından 18 yılında izole edilen I. crassa 2KSuPT2018 suşunu kullandık. Yumru, açık kahverengi miselyumla kaplı bir oyuğa sahip kuru bir çürüklük türünden etkilendi. Steril bir kesme iğnesi kullanılarak mantar miselyumu, bir agar ortamı (bira mayşesi% 10, ağar% 1.5, penisilin 1000 U / ml) içeren bir Petri tabağına aktarıldı. Plakalar karanlıkta 24 ° C'de inkübe edildi.
Sporların ve spor organlarının fotoğrafını çekmek, boyutunu ve morfolojisini fotoğraflamak, değerlendirmek için bir ICC2500 HD dijital kameralı bir Leica DM50 ışık mikroskobu ve IC80HD dijital kameralı bir Leica M80 binoküler mikroskop (Leica Microsystems, Almanya) kullanıldı.
DNA'yı izole etmek için, mantar miselyumu sıvı bezelye ortamında büyütüldü, daha sonra sıvı nitrojen içinde donduruldu, homojenize edildi, CTAB tamponunda inkübe edildi, kloroform ile saflaştırıldı ve iki kez% 2 alkol ile yıkandı.
DNA ekstraksiyon yöntemi, Kutuzova ve ark.'nın yazdığı makalede ayrıntılı olarak anlatılmıştır. (2017).
Türleri moleküler yöntemlerle belirlemek ve diğer bilinen I. crassa türleriyle karşılaştırmak için, türe özgü DNA bölgelerinin amplifikasyonuna izin veren primerlerle PCR gerçekleştirildi: ITS1-5,8S-ITS2 (primerler ITS5 / ITS4, White ve diğerleri, 1990), gen bölgeleri b - tubulin (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) ve translasyon uzatma faktörü 1α (teflα) (primerler EF1-1F / EF728-1R, Carbone ve Kohn, 986). İstenen uzunlukta amplikonlar, Evrogen CleanUp kit kullanılarak jelden ekstrakte edildi. Amplifiye edilen bölgeler, Applied Biosystems 1999 xl otomatikleştirilmiş sıralayıcı (Applied Biosystems, CA, ABD) üzerinde BigDye® Terminator v3.1 Döngü Sekanslama Kiti (Applied Biosystems, CA, ABD) kullanılarak sekanslandı. Elde edilen nükleotid dizileri, ABD Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI) GenBank veritabanında bir eşleşme aramak için kullanıldı. Filogenetik analiz, MEGA 3730 programı (Tamura ve diğerleri, 6) kullanılarak yapılmıştır.
Virülans tayini, büyük meyveli domatesin (Dubrava çeşidi) ve patates yumrularının (Gala çeşidi) bütün yeşil meyveleri üzerinde gerçekleştirildi. Ek olarak, zarar görmüş meyvelerin ve yumru köklerin zarar görmesini simüle etmek için aynı meyve ve yumrulardan dilimler kullandık. Yumru dilimleri, altta ıslak filtre kağıdı bulunan Petri kapları olan nemli odalara yerleştirildi. Kağıda, üzerine yumru veya meyve dilimlerinin yerleştirildiği bir slayt yerleştirildi. Tüm yumrular ve meyveler de altta ıslak filtre kağıdı bulunan kaplara yerleştirildi. Dilimin ortasına (veya yumru veya meyvenin sağlam yüzeyine), fungal hifli bir agar parçası (5x5 mm), wort agar üzerinde 5 gün büyümeden sonra yerleştirildi.
Mantar türlerinin fungisitlere karşı direncinin değerlendirilmesi, agar besiyerinde laboratuar koşullarında gerçekleştirilmiştir. Mantar öldürücü ilaçlara duyarlılığı inceledik, Maxim, KS (aktif bileşen fludioxonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoxystrobin 250 g / l), Scor, EC (difenokonazol 250 g / l) (Devlet kataloğu ..., 2020). Değerlendirme, incelenen ilaçların 0.1 aktif madde konsantrasyonlarında eklenmesiyle, Petri kaplarında wort-agar ortamı üzerinde gerçekleştirildi; bir; 1 ppm (mg / L) (fludioksonil ve difenokonazol için), 10; on; 1 ppm (azoksistrobin için) ve fungisit içermeyen ortamda (kontrol). Mantar öldürücü eritilene eklendi ve 10 ° C ortama soğutuldu, ardından ortam Petri kaplarına döküldü. Mantar miselyumlu bir agar bloğu, bir Petri tabağının ortasına yerleştirildi ve karanlıkta 100 ° C'lik bir sıcaklıkta kültürlendi. 60 günlük inkübasyondan sonra, kolonilerin çapları karşılıklı olarak iki dik yönde ölçüldü; her koloni için ölçüm sonuçlarının ortalaması alınmıştır. Deneyler, üç kopya halinde yapıldı. Analizlerin sonuçlarına dayanarak, EC24, fungisit kontrolüne göre koloninin radyal büyüme oranını yarıya indiren fungisit konsantrasyonuna eşit olarak hesaplandı.
sonuçlar ve tartışma
Wort agarlı petri kaplarında mantar, beyaz topaklanmış miselyumlu koloniler oluşturdu. Miselyumun altındaki ortam kırmızı-kahverengiye dönüştü. Besiyeri kuruduğunda, mantar küçük sporodochia'da tek ve kümelenmiş konidiyoforlar üzerinde iki tip spor oluşturdu. Makrokonidiler uzatılmış, silindiriktir, bir ila üç septa, ortalama uzunluk 27.2 µm, 23.2 ila 32.2 µm değer aralığında, genişlik - 4.9 µm'ye kadar (Şekil 1). Mikrokonidia'nın ortalama uzunluğu 14.3 um'dir ve 10.3 ila 18.1 um arasında değişen değerler, genişlik 4.0 um'ye kadardır. Tüm makro ve mikromorfolojik karakterler, Ilyonectria crassa türünün varyasyon aralığına uyar (Cabral ve diğerleri, 2012).
Türe özgü DNA bölgelerinin sekansları (ITS, b-tubulin, TEF 1α), daha önce çalıştığımız I. crassa suşlarının sekanslarıyla tamamen çakıştı (Chudinova ve diğerleri, 2019, Tablo 1). I. crassa'nın diğer bölgelerdeki prevalansını incelemek ve etkilenen kültürlerin spektrumunu analiz etmek için GenBank veri tabanındaki benzer DNA dizileri analiz edildi (Tablo 1). Örtüşme% 86 ile 100 arasındaydı. "Patates" I. crassa suşunun üç DNA bölgesinin tamamının sekansları, Hollanda'daki zambak soğanı ve nergis köklerinden ve Kanada'daki ginseng kökünden izole edilen suşların sekanslarıyla aynıydı. Açık veri tabanlarında analiz edilen üç benzer diziye sahip diğer I. crassa suşlarını bulamadık. Bununla birlikte, biriktirilen ITS ve b-tubulin dizilerinin analizi, Birleşik Krallık'ta lale yapraklarında I. crassa varlığını göstermiştir. Kanada'daki kavak köklerinin ve İtalya'daki kayın köklerinin ve Suudi Arabistan'daki patates yumrularının mikobiyotası analiz edilirken benzer bir ITS sekansına sahip mantarlar belirlendi (Tablo 1). Bu çalışmanın sonuçları, I. crassa'nın küresel bir dağılıma sahip olduğunu ve çeşitli bitki türlerini enfekte edebildiğini göstermektedir.
5. günde domates ve patates dilimlerinde patojenite belirlenirken lezyonun çapı 1.5 cm'ye ulaştı Araştırılan suş, bütün domates meyvesini ve bozulmamış patates yumruunu enfekte etmedi. Ancak domates üzerinde sepals etkilendi. Patates yumru diliminde gelişen miselyumdan kontaminasyon olasılığını ortadan kaldırmak için, saf bir kültür halinde bir mantar izolatı izole edildi. Ebeveyn türüyle tamamen aynıydı. Görünüşe göre I. crassa bir yara parazitidir.
Tohum yumrularının fungisitlerle dikim öncesi muamelesi, büyüme mevsimi boyunca bitkilerde hastalıkların gelişmesini azaltır. Etkili fungisitlerin seçimi için, hangilerinin I. сrassa'ya karşı etkili olduğunu değerlendirmek önemlidir. Çalışma, fungisitlerin yaygın aktif maddelerini inceledi - fludioksonil, azoksistrobin, difenokonazol. Fludioxonil, ekimden önce tohumları ve tohum yumrularını kaplamak için kullanılan çeşitli karışımlara dahil edilir. Fludioxonil (Maxim) ayrıca depolamadan önce tohum yumrularını tedavi etmek için kullanılır. Difenokonazol ve azoksistrobin, tohum materyalinin işlenmesi için kullanılan bir dizi müstahzarın yanı sıra vejetatif bitkilerin işlenmesine yönelik müstahzarlara da dahil edilir (Devlet kataloğu ..., 2020).
I. crassa'nın büyüme hızı, farklı konsantrasyonlarda aktif madde içeren ortam (Şekil 2) üzerinde çalışıldı: fludioksonil (EC50 = 0.4 ppm), azoksistrobin (EC50 = 4 ppm) ve difenokonazol (EC50 = 7.4 ppm) (Tablo 2). Bu preparatların I. crassa'ya karşı oldukça etkili oldukları kabul edilebilir, çünkü bunların EC50'si yumru köklerin işlenmesi için kullanılan çalışma sıvısındaki preparatın tavsiye edilen konsantrasyonundan önemli ölçüde düşüktür. Durum Kataloğuna göre ... (2020), patates yumrularını tedavi etmek için sıvıda fludioksonil konsantrasyonu 500 ila 1000 ppm, azoksistrobin (karık altını tedavi etmek için sıvı içinde) - 3750-9375 ppm, difenokonazol (bitkisel bitkileri tedavi etmek için sıvıda) - 187.5– 625 ppm.
Tablo 1. Genbank veri tabanında bulunan 18KSuPT2 suşu ve Ilyonectria crassa suşlarının türe özgü sekanslarının sekans benzerliği
Gerginlik | Ev sahibi bitki, boşaltım yeri | GenBank'ta depolanan sıra numaraları, benzerlik yüzdesi | Bağlantı | ||
ONUN | β-tübülin | TEF 1α | |||
17KSPT1 ve 18KSuPT2 | Patates yumru, Kostroma bölgesi | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova ve diğerleri, 2019, bu çalışma |
CBS158/31 | Nergis kökleri, Hollanda | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral vd., 2012 |
CBS139/30 | Zambak soğanı, Hollanda | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Ginseng kökü, Kanada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Lale yaprağı, İngiltere | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Aspen kökleri, Kanada | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield ve diğerleri, 2020 |
ER1937 | Kayın, İtalya | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Doğrudan gönderim |
KAUF19 | Patates yumru, Suudi Arabistan | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = yatırılmamış
Tablo 2. Ilyonectria crassa'nın mantar öldürücülere direnci
(aktif madde) | EC50, ppm | ||||
3 gün | 5 gün | 7 gün | |||
Kontrol | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fsoxystrobin) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (fludioksonil) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EC (difenokonazol) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
Çalışmamızda Kostroma ve Moskova (Chudinova vd., 2019) bölgelerindeki patates yumrularından I. crassa suşları izole edilmiştir. Suudi Arabistan'daki patates yumrularının mikobiyotası analiz edilirken I. crassa ile özdeş ITS sekanslarına sahip yüksek oranda mantar suşu ortaya çıktı (Gashgari ve Gherbawy, 2013). Görünüşe göre, I. crassa patateslerde göründüğü kadar nadir değildir. Deneylerimiz, mantarın zarar görmüş domates meyvelerini enfekte edebileceğini gösterdi. Literatürden, I. crassa'nın toprakta saprotrofik olarak gelişebildiği (Moll vd., 2016) ve çeşitli bitkileri, hatta taksonomik olarak uzak olan nergis, zambak, ginseng, titrek kavak ve kayın gibi bitkileri etkilediği bilinmektedir (Tablo 1). bir). Görünüşe göre, birçok yabani ve bahçe bitkisi I. crassa'nın rezervleri olabilir. Yukarıdakiler, koruma önlemleri geliştirilirken, bu mantarla patates yumrularını etkileme olasılığını hesaba katmanın gerekli olduğunu göstermektedir. Fludioksonil, azoksistrobin ve difenokonazol içeren patates yumrularının tedavisi için yaygın preparatlar, I. crassa'ya karşı yüksek fungisidal etkinlik göstermiştir.
Bu çalışma, Rusya Temel Araştırma Vakfı (Grant No. 20-016-00139) tarafından desteklenmiştir.
Makale "Bitki Koruma Bülteni", 2020, 103 (3) dergisinde yayınlandı.